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lunes, 31 de agosto de 2009

Mutagénesis aleatoria

En la entrada anterior del blog estuve comentando una de las técnicas que estaba llevando a cabo en el laboratorio. Ahora voy a hablaros de otra, que si bien aun no he hecho, pronto estará dentro de los procedimientos aprendidos durante este periodo de beca.

proteomics_graphics7[1] Como ya expliqué en la entrada anterior es muy fácil hacer substituciones de unos aminoácidos por otros mediante la construcción de oligos que ya incluyen las mutaciones y por amplificación con PCR. Esto se puede realizar si se conocen muy bien los efectos que va a provocar la introducción de la mutación, aun así en muchas ocasiones el resultado que se obtiene no es el esperado porque se sustituye un aminoácido pensando en el efecto directo que va a causar esta sustitución pero se desconoce totalmente los posibles efectos que va a tener en el resto de la estructura de la proteína. Ya que la sustitución del residuo puede provocar un cambio de orientación en otro residuo situado a decenas de pares de bases y que incluso afecte a la actividad catalítica de forma negativa y produzca un efecto totalmente contrario al esperado.

Por eso en determinados casos la mutagénesis aleatoria puede ser muy útil para lo que se conoce como diseño racional. La mutagénesis aleatoria se puede conseguir de diferentes formas, mediante agentes químicos, como por ejemplo la hidroxilamina, el ácido nitroso, cambiando la concentración de Mg 2+ que actúa como cofactor en la DNA pol, mediante PCR y con diferentes oligos con mutaciones al azar, etc.. Pero estas técnicas quedan restringidas a regiones concretas del gen.

Uno de los métodos más interesantes (al menos desde mi punto de vista) y bastante utilizado para la obtención de proteínas modificadas es la evolución dirigida.

Este proceso intenta imitar el proceso de evolución darwiniana pero in vitro, combinando las mutaciones genéticas con la selección natural. La evolución dirigida consta de dos etapas diferenciadas, por un lado una etapa de mutagénesis aleatoria que se consigue mediante la técnica conocida como DNA-shuffilg que consiste en una primera etapa de PCR normal y posteriormente en una digestión con DNAsa. Del producto de la digestión se seleccionan los fragmentos de entre 50 y 150 pb y se usan como cebadores  para la siguiente PCR. Además se usa una polimerasa de baja eficiencia que introduce mutaciones con mayor frecuencia que las que se usan habitualmente en PCR.

El producto de todo este proceso es clonado en un vector para ser expresado en E.coli y posteriormente se chequean los mutantes y se seleccionan aquellos que tienen mayor interés.

Se obtendrá un mayor éxito cuanto mayor sea el número de variantes fenotípicas obtenidas puedan ser examinadas y en muchas ocasiones se llega a la conclusión de que las proteínas estudiadas son mucho más flexibles a la hora de incluir mutaciones de lo que se pensaba.

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