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lunes, 8 de marzo de 2010

La inmunoprecipitación selectiva de cromatina

image Tuve la oportunidad de conocer esta técnica durante mi colaboración en el laboratorio de genómica de levaduras, y ya me sorprendió en su idea la elegancia con la que se podía precipitar la cromatina con esta técnica, y además de forma selectiva.


Muchas veces en biología molecular se desea conocer si una proteína de interés interacciona con el DNA

   y cuáles son los genes que regula. Para esto una de las técnicas que se utiliza es la inmunoprecipitación selectiva de cromatina.

Esta técnica tiene la ventaja de que se puede realizar in-vivo. Por ejemplo, nos puede interesar si nuestra proteína regula la transcripción ante una situación de estrés. Tras someter a las células a algún tipo de estrés, por ejemplo alta concentración de sales, se puede aplicar alguna sustancia que entrecruce las proteínas que interaccionan con el DNA, mediante glutaraldehído por ejemplo.

Una vez se produce el entrecruzamiento se lisan las células y el DNA se rompe en fragmentos mediante sonicación en fragmentos de 0,2 a 1 KB.

Hasta este punto no hemos utilizado ninguna técnica inmunológica, es ahoraimage cuando entra en juego la inmunoprecipitación. Tenemos una mezcla de fragmentos de cromatina con proteínas unidas a través del crosslink ahora hay que separar nuestra proteína de interés del resto y esto se va a conseguir mediante inmunoprecipitación.

Tendremos un anticuerpo para nuestra proteína de interés adherida por ejemplo a un soporte físico como por ejemplo esferas de algún tipo de polímero (sefarosa). Tras aplicarlas a nuestra muestra el anticuerpo se unirá a nuestra proteína que a su vez llevará unido el DNA. Tras centrifugar en el fondo de nuestro tubo quedarán las esferas con el complejo proteína-DNA.

Una vez separada esta fracción del resto de la muestra se revierte el crosslinking. Mediante técnicas de biología molecular se precipita de forma selectiva el DNA y mediante PCR se amplifica. Una vez amplificado se puede secuenciar, de esta manera conoceremos la secuencia a la que se une la proteína y podemos ver en las bibliotecas de genómica (si está secuenciado) que gen o genes controla.

Si se hace para todas las proteínas que hay unidas en el DNA en lugar de secuenciar se hibrida el DNA en chips genómicos, en este caso se conoce como ChIP on ChIP.

2 comentarios :

Anónimo dijo...

hola, me gusto tu muro, esta muy esquematico para la comprension de la tecnica. gracias...

Anónimo dijo...

Me ha sido de gran ayuda, buena explicación. Muchas gracias.