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lunes, 12 de julio de 2010

Producción de proteína en un sistema heterólogo

Muchas veces, para realizar estudios de interacción de proteínas, activación, inhibición…etc. se usan sistemas in-vitro con medios de reacción controlados. Es decir, se conoce todos los componentes del medio de reacción. En este caso se necesitan las distintas proteínas purificadas y no mezcladas con otros componentes y proteínas como puede suimageceder en un ensayo con extracto de células.

La producción de proteínas es muy habitual en los laboratorios, y se usan como medios de producción microorganismos fáciles de cultivar en el laboratorio. En la mayoría de estos casos E.coli es la estrella. Es tan fácil como transformar la bacteria con un plásmido que contenga nuestra proteína de interés, con un promotor de expresión fuerte (ya sea constitutivo o inductivo, eso ya a gusto del consumidor) y simplemente esperar a que la naturaleza haga su curso. Si nuestra proteína es eucariota ya se complica algo más el asunto, ya que muchas de ellas tienen modificaciones postraduccionales, y la mayoría de ellas contienen intrones en el pre-mRNA que deben ser procesados antes de ser traducidos. El problema es que E.coli carece de estos mecanismos, por eso que se transforma con un cDNA, una copia idéntica del mRNA, de esta manera E.coli  produce la proteína de forma directa.

imageUna vez tenemos la proteína hay que purificarla para aislarla de lo que no nos interesa y puede ser una odisea en algunos casos. En el caso de la proteína con la que estoy trabajando, Apaf-1, usamos columnas de sepharosa. La sepharosa tiene afinidad por la GST, por eso se ha creado una proteína de fusión con Apaf-1_GST. Posteriormente el extracto celular se filtra a través de las columnas con sepharosa quedando retenido el GST y por tanto nuestra proteína Apaf-1. Una vez ha pasado todo el extracto por la columna tan sólo queda eluir nuestra proteína de interés y esto se consigue con un enzima que corta justo en el punto de unión de la GST y Apaf-1, liberándose Apaf-1 que ya puede ser recogida y preparada para su conservación en frío.

2 comentarios :

Anónimo dijo...

mil gracias por la info!

Anónimo dijo...

Quisiera saber cual es la verdadera definición de vida?