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miércoles, 3 de marzo de 2010

El uso de la GFP como Chivato en Biología celular













La GFP o green fluorescent protein es una proteína producida por la medusa Aequorea victoria que emite bioluminiscencia en la zona del verde del espectro ArchivoAequorea victoria.jpgvisible. El avance en las técnicas de biología molecular han permitido aislar este gen y en la actualidad es un marcador muy común en biología molecular y celular, además mediante modificaciones en la secuencia de aminoácidos mediante mutagénesis dirigida se ha conseguido variar el espectro de emisión de manera que en la actualidad hay GFP que emite en el amarillo (YFP) o en el rojo (RFP).







  
render (Raster3D) input file, MolScript v2.1.2, Copyright (C) 1997-1998 Per J. Kraulis
Este gen de la GFP mediante técnicas de biología molecular e ingeniería genética puede combinarse con otros genes. De manera que si queremos transformar o transfectar (en el caso de eucariotas) nuestras células con algún tipo de gen podemos usar la GFP como marcador. Tan sólo hay que poner en pauta la GFP con el gen de interés bajo un mismo promotor. De esta manera aquellas células que hayan incorporado el DNA con nuestro gen de interés podrán ser detectadas bajo un microscopio de fluorescencia porque emitirán un brillo verde al ser excitadas por la luz. Todas aquellas células que expresen la GFP estarán expresando el gen que está controlado bajo el mismo promotor, aunque la traducción de este gen no de lugar a ningún cambio perceptible a través del microscopio.

Una de las principales ventajas de la GFP es que no daña la viabilidad celular, de manera que si en un  cultivo de células que han sido sometidas a un proceso de transfectación el porcentaje de células transfectadas ha sido bajo pueden aislarse aquellas que estén brillantes mediante una micropipeta y establecer una línea de cultivo celular con ellas.

La GFP en la actualidad tiene múltiples usos y múltiples combinaciones en la actualidad, tanto como para llenar páginas y páginas con ejemplos. No obstante las fotos que os voy a colgar son de la práctica que hice la semana pasada en biología celular. En este caso se transfectaron células HEK 293 T con un plásmido portador de la GFP mediante dos protocolos ligeramente distintos para ver cuál de los dos era más efectivo a la hora de transfectar.

Para ver los resultados simplemente se ha utilizado un fluorocromo para DNA, el DAPI (color azul) y la propia bioluminiscencia de la GFP. Aquellas células que hayan incorporado nuestro gen de la GFP (y expresado) serán de color verde brillante. Ahora tan sólo queda ver la proporción entre células que lo han incorporado (verdes) del total de células que se pueden contar gracias al marcaje con DAPI que nos marca los núcleos. Aquí tenéis algunas de las fotos obtenidas:



























Células con DAPI: núcleos marcados en azul para hacer el recuento total de células

 A_alta_DAPI01

































Células con GFP: es la misma foto anterior pero con el filtro verde en el microscopio de fluorescencia







































A_alta_GFP01 
Superposición de ambas fotos:

A_alta_merge01








2 comentarios :

GREE dijo...

hola me gustaria saber si me puieden ayudar con esta pregunta:
5. Si se marca con GFP, que parte de la celula sera fluorescente (localización)
mi gen es VAV1 :/ nose como hacerlo pro mas que busco no encuentro espeor q me puedan ayudar lo ma spronto posible gracias!

David Talens dijo...

A ver...desconozco el gen VAV1 pero es fácil...lo único que tienes que ver es buscar información sobre el gen y ver cuál es su función. Si codifica para una proteina de membrana...citoplasmática...etc. Con lo cual, donde vaya lo que codifica el gen VAV1 irá la GFP y por tanto la fluorescencia...si se trata de una proteína que interacciona con otra...dependiendo de la situación puede que esté en el citoplasma (por ejemplo si está disociada) o en la membrana (si su molécula diana se encuentra en la membrana) por ponerte un ejemplo. Un saludo