Hoy os traigo el último trabajo acerca de lactasas y que cierra algunos de los flecos de resultados derivados de la tésis doctoral y que todavía no habían sido publicados.
Como ya sabéis la lactosa es, al mismo tiempo, un nutriente esencial y un desafío ya que una parte considerable de la población adulta presenta dificultades para digerirla, lo que ha impulsado en las últimas décadas una expansión constante de los productos sin lactosa y de los alimentos enriquecidos en galactooligosacáridos, compuestos con efectos prebióticos beneficiosos para la salud intestinal. Detrás de esta tendencia se encuentra una enzima clave: la lactasa, capaz de romper el enlace entre glucosa y galactosa. Aunque la industria utiliza de forma habitual la lactasa procedente de la levadura Kluyveromyces lactis, desde hace años se buscan alternativas que puedan tener mejores propiedades, como por ejemplo una mayor termoestabilidad. Un ejemplo de ello es la β-galactosidasa TmLac de Thermotoga maritima. Su extraordinaria resistencia térmica la convierte en una candidata ideal para procesos industriales en condiciones severas, aunque presenta un inconveniente importante: es menos eficiente que la lactasa de levadura en la hidrólisis de lactosa.
En este trabajo se combinaron tres estrategias complementarias para mejorar esta enzima y explorar alternativas naturales: ingeniería racional, evolución dirigida y cribado bioinformático para buscar nuevas candidatas. La primera de ellas se centró en la comparación estructural entre TmLac y la lactasa de K. lactis, cuyo rendimiento superior parecía estar relacionado con la presencia de un bucle estructural que facilitaba la entrada y orientación de la lactosa en el sitio activo. El equipo decidió entonces introducir ese bucle en TmLac, generando la variante TmLacS_SL. A pesar de lo prometedor de la idea, la enzima modificada mostró una actividad entre cinco y diez veces menor que la original y una ligera pérdida de estabilidad térmica. La introducción de más de veinte aminoácidos en una región crítica resultó ser demasiado disruptiva: el bucle no adoptó la conformación esperada y terminó alterando el entorno catalítico. Es un ejemplo clásico de los límites de la ingeniería racional: aunque la estructura sugiere mejoras potenciales, las proteínas son sistemas complejos donde pequeños cambios pueden desestructurar regiones enteras.
Ante esa dificultad, el estudio recurrió a un enfoque más evolutivo. Mediante DNA shuffling se generaron miles de variantes recombinantes de TmLacS y TmLacS_SL, que se evaluaron experimentalmente para detectar incrementos de actividad. Aquí surgió uno de los resultados más significativos: el mutante TmLacS 3H6, que contiene tres mutaciones consecutivas en una región lejana al centro catalítico. Esas sustituciones rompen un puente salino entre dos dominios, reduciendo la rigidez de la proteína. Como consecuencia, la enzima pierde parte de su estabilidad térmica, pero gana flexibilidad y eficiencia catalítica. El mutante 3H6 multiplicó por más de cuatro la actividad lactasa de la TmLac original y, además, duplicó la síntesis de galactooligosacáridos frente a la enzima nativa.
La tercera estrategia del estudio fue seguir buscando alternativas en la naturaleza usando como fuente bases de datos de secuencias anotadas pero no caracterizadas. La familia GH2, a la que pertenecen estas β-galactosidasas, contiene decenas de miles de proteínas, pero solo una fracción mínima ha sido estudiada experimentalmente. Se amplió el árbol filogenético previo desarrollando durante la tesis doctoral, incorporando más de doscientas secuencias procedentes de microorganismos termófilos y buscó aquellas que se agrupaban cerca de las enzimas de Bifidobacterium, conocidas por su elevada capacidad para hidrolizar lactosa y producir GOS. Tras un proceso de filtrado y selección, se eligieron cinco candidatos, de los cuales cuatro pudieron expresarse y caracterizarse: TeLac, PsTheLac, ThStLac y CalHydLac.
El análisis estructural reveló diferencias notables en la arquitectura del sitio activo de estas enzimas, lo que explicaba su distinto comportamiento frente a la lactosa. Dos de ellas mostraron actividad exclusivamente frente a sustratos artificiales, lo que indica cavidades demasiado profundas o estrechas para acomodar la lactosa natural. Sin embargo, una de ellas destacó claramente sobre las demás: TeLac, procedente de Thermoanaerobacter pseudethanolicus. Esta enzima mostró una actividad superior a todas las demás probadas en este trabajo, más del doble que la lactasa comercial de K. lactis, y fue capaz de hidrolizar completamente la lactosa presente en leche en apenas una hora a 60 °C. Además, su capacidad para producir diferentes tipos de GOS, y con ellos un rendimiento total cercano al 32 %, la posiciona como una herramienta muy prometedora para la industria de los alimentos funcionales. Aunque TeLac no alcanza la extraordinaria estabilidad térmica de TmLac, su velocidad, versatilidad y compatibilidad con condiciones de pasteurización la convierten en una candidata ideal para procesos industriales donde se busca un compromiso óptimo entre temperatura, rendimiento y coste operativo.
Los resultados demuestran la fuerza de combinar la ingeniería racional, la evolución dirigida y la minería bioinformática para descubrir o generar nuevas biocatalizadores con aplicaciones reales en la industria. Os dejo el enlace al artículo por si tenéis curiosidad:
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