Translocación de proteínas a través de membrana del Retículo Endoplásmico

Uno de los problemas que se plantearon los investigadores en su época (hablamos de los años 70…) es cómo las proteínas podían pasar a través de la membrana. Como todos vosotros sabéis las membranas son impermeables a una gran parte de compuestos y entre ellos las proteínas, por tanto la translocación de proteínas a través de la membrana se desconocía.

Hoy en día gracias a los experimentos realizados por científicos como Günter Blobel o Bernhard Dobberstein, no es difícil encontrar en los libros de texto un tema dedicado a la translocación de proteínas a través del retículo endoplásmico y es una pregunta clásica en exámenes, desde el bachillerato pasando por selectividad y llegando a cursos superiores de las carreras universitarias, eso sí con un incremento en el grado de detalle.

En esta entrada vamos a ver algunos de los rasgos de este mecanismo de translocación de proteínas.

En primer lugar,  y tal y como se vio mediante los experimentos, los mRNAs de proteínas de secreción traducidos in-vitro (sólo con extractos celulares) e in vivo no tenían la misma longitud. In vivo las proteínas resultantes eran más cortas que in vitro. De aquí se dedujo la presencia de un péptido señal.

Todas aquellas proteínas que van a pasar al lumen del RE poseen un péptido señal en la propia proteína que es eliminado tras ser translocada al lumen, explicando así las diferencias de tamaño.

A medida que el mRNA es traducido por el ribosoma aparece el péptido señal. Este péptido señal a pesar de no tener una secuencia consenso sí que comparte una serie de características comunes que son la presencia de un núcleo de aminoácidos apolares flanqueado por aminoácidos con carga. Nada más aparecer el péptido señal se le une la partícula SRP, que es una ribonucleoproteina que va a unirse al péptido señal por el dominio p54 que forma un bolsillo hidrofóbico de metioninas y a su vez al ribosoma, justo en el sitio en donde se interacciona el factor de elongación parando así la traducción de la proteína.

En ese momento SRP dirige al ribosoma y la cadena naciente a la superficie de la membrana del RE en dónde SRP tiene su receptor, en ese momento se produce la unión de GTP (la unión de la proteína y el receptor generan un sitio de unión de GTP) la hidrólisis de GTP a GDP produce un cambio conformacional que facilitan la liberación de SRP y del receptor quedando el  ribosoma anclado al translocón o Sec61. La interacción del péptido señal con el poro permite que se abra el paso del canal para que la proteína sea translocada.

A medida que se transloca la proteína al lumen el péptido señal es cortado por una peptidasa y la proteína naciente modificada mediante puentes disulfuro, glicosilaciones…hasta que alcanza la conformación definitiva.

Aquí tenéis un video de este proceso tan archiconocido en biología:

 

 

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El uso de la GFP como Chivato en Biología celular

La GFP o green fluorescent protein es una proteína producida por la medusa Aequorea victoria que emite bioluminiscencia en la zona del verde del espectro visible. El avance en las técnicas de biología molecular han permitido aislar este gen y en la actualidad es un marcador muy común en biología molecular y celular, además mediante modificaciones en la secuencia de aminoácidos mediante mutagénesis dirigida se ha conseguido variar el espectro de emisión de manera que en la actualidad hay GFP que emite en el amarillo (YFP) o en el rojo (RFP).







  

Este gen de la GFP mediante técnicas de biología molecular e ingeniería genética puede combinarse con otros genes. De manera que si queremos transformar o transfectar (en el caso de eucariotas) nuestras células con algún tipo de gen podemos usar la GFP como marcador. Tan sólo hay que poner en pauta la GFP con el gen de interés bajo un mismo promotor. De esta manera aquellas células que hayan incorporado el DNA con nuestro gen de interés podrán ser detectadas bajo un microscopio de fluorescencia porque emitirán un brillo verde al ser excitadas por la luz. Todas aquellas células que expresen la GFP estarán expresando el gen que está controlado bajo el mismo promotor, aunque la traducción de este gen no de lugar a ningún cambio perceptible a través del microscopio.

Una de las principales ventajas de la GFP es que no daña la viabilidad celular, de manera que si en un  cultivo de células que han sido sometidas a un proceso de transfectación el porcentaje de células transfectadas ha sido bajo pueden aislarse aquellas que estén brillantes mediante una micropipeta y establecer una línea de cultivo celular con ellas.

La GFP en la actualidad tiene múltiples usos y múltiples combinaciones en la actualidad, tanto como para llenar páginas y páginas con ejemplos. No obstante las fotos que os voy a colgar son de la práctica que hice la semana pasada en biología celular. En este caso se transfectaron células HEK 293 T con un plásmido portador de la GFP mediante dos protocolos ligeramente distintos para ver cuál de los dos era más efectivo a la hora de transfectar.

Para ver los resultados simplemente se ha utilizado un fluorocromo para DNA, el DAPI (color azul) y la propia bioluminiscencia de la GFP. Aquellas células que hayan incorporado nuestro gen de la GFP (y expresado) serán de color verde brillante. Ahora tan sólo queda ver la proporción entre células que lo han incorporado (verdes) del total de células que se pueden contar gracias al marcaje con DAPI que nos marca los núcleos. Aquí tenéis algunas de las fotos obtenidas:



























Células con DAPI: núcleos marcados en azul para hacer el recuento total de células

 

































Células con GFP: es la misma foto anterior pero con el filtro verde en el microscopio de fluorescencia







































 
Superposición de ambas fotos:

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¿Cómo se generan los anticuerpos que se usan en el laboratorio? (II)

En una entrada anterior se habló de la forma más común de la obtención de anticuerpos, los anticuerpos policlonales.En este caso vamos a hablar del segundo tipo de anticuerpos más comunes, los monoclonales.

La ventaja de los anticuerpos monoclonales es la especificidad y la producción ilimitada. Los anticuerpos monoclonales detectan un único epítopo, al contrario de lo que ocurría con los anticuerpos policlonales en que la inmunización del animal daba lugar a un antisuero con una batería de anticuerpos capaz de detectar multitud de epítopos.

¿Cómo se obtienen los anticuerpos monoclonales?

En primer lugar y tal y como ocurre con la obtención de anticuerpos policlonales hay que obtener el antígeno purificado e inyectarlo en un animal.

Una vez se ha obtenido la respuesta inmune se extraen del bazo del animal linfocitos que ya habrán sido activado por el antígeno. Si estos linfocitos se cultivasen en placas morirían al poco tiempo. Para que esto no ocurra los linfocitos se fusionan con células de mieloma dotándolas de inmortalidad, en este caso ya se pueden mantener de forma permanente en cultivo.

Mediante diluciones seriadas al final se consigue tener un sólo linfocito por pocillo de cultivo, de esta manera se consigue multiplicar los linfocitos, capaces de producir anticuerpos frente a un epítopo diferente. Posteriormente estos clones se pueden ensayar para ver cuál es el que detecta nuestro epítopo de interés y una vez detectado esta línea celular se puede mantener sin ningún tipo de problema con el paso del tiempo.

La ventajas frente a los policlonales dependen del experimento que se quiera realizar. En ocasiones conviene distinguir proteínas en las que tan sólo difiere un dominio y en este caso los anticuerpos monoclonales al ser más específicos, ya que sólo reconoce un epítopo, nos permitirá trabajar con mayor precisión que con los policlonales permitiendo incluso diferenciar entre esteroisómeros.

Ir a: ¿Cómo se generan los anticuerpos que se usan en el laboratorio? (I)

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La higuera y su característica forma de polinización

El mundo vegetal esconde a menudo curiosidades de lo más variopintas. Una de las cosas que siempre me ha maravillado son las formas de polinización que podemos encontrar, entre ellas aquellas que implican otros organismos como pájaros, murciélagos o la típica que todos conocemos de insectos.

Hoy me centraré en un ejemplo curioso, la polinización de la conocida como higuera o Ficus carica, aunque puede darse también en otros ejemplares del género Ficus.

Paralelamente al desarrollo del ciclo vital de esta planta, se desarrolla el ciclo de su polinizador, una avispa de pequeño tamaño del género Blastophaga. Aunque hay higueras que son partenogenéticas y dan frutos sin necesidad de polinización, en otros casos, la presencia de esta avispa es de vital importancia para la salida de los frutos.

Ficus carica, presenta sólo flores femeninas con el estilo largo (longistilas), de modo que para que se lleve a cabo la polinización tiene que darse la polinización cruzada con otra higuera silvestre que tenga flores masculinas y femeninas, ambas fértiles.

Las avispas hembras, entrarán en las inflorescencias para depositar los huevos, de manera que al llegar al interior puede encontrarse con que haya flores con el estilo largo o flores con el estilo corto (en donde las avispas ponen sus huevos ya que su ovopositor únicamente les permite ponerlos en estas flores). Una vez depositados los huevos, los machos serán los primeros en emerger e intentar excavar un túnel de salida.

A continuación saldrán las hembras a la vez que las flores masculinas maduran, se produce la fecundación de las avispas y las hembras fecundadas salen cargadas de polen para ir a otra higuera en la que si no hay flores longistilas no podrá depositar los huevos, pero sí polinizar.

Este es un ejemplo más de la complejidad de las relaciones que pueden existir en la naturaleza, en la que dos especies que vienen de reinos diferentes, confluyen en un mismo punto, tras una relación de seguramente millones de años, para llevar a cabo su reproducción y asegurar la perpetuidad de su especie.

¿Cómo se generan los anticuerpos que se usan en el laboratorio? (I)

Hoy en día en los laboratorios de biología molecular, histología, fisiología…el uso de anticuerpos para la detección de moléculas están a la orden del día y forman parte de diferentes técnicas.

Los anticuerpos para el uso en laboratorio se diferencian en policlonales y monoclonales. Los policlonales constituyen una batería de anticuerpos capaces de detectar distintos epítopos de un mismo antígeno, mientras que los monoclonales sólo son capaces de detectar un epítopo. ¿Cuáles son mejores? Pues, depende del uso y de la técnica, en unas ocasiones nos convendrá la detección de distintos epítopos, como por ejemplo cuando hagamos una inmunocitoquímica sobre un tejido histológico fijado en que los epítopos de interés pueden quedar desnaturalizados por el fijador (en este caso tener varios anticuerpos que detecten diferentes epítopos es ventajoso) pero otras veces nos interesa diferenciar incluso a nivel de dominios o esteroisómeros y en este caso convienen más los monoclonales.

¿Cómo se obtienen los anticuerpos policlonales?

Son los más habituales en el laboratorio. En primer lugar hay que purificar lo máximo posible el antígeno, en el caso de que sea una molécula antigénica pero no inmunogénica (es decir incapaz de inducir la respuesta inmune) se utilizará una proteína que funcione como carrier, como por ejemplo la albumina bovina.

Una vez purificado el antígeno y preparado para inyectar con adyuvantes, etc es hora de elegir el animal. Normalmente para la producción de anticuerpos primarios se utiliza rata o conejo porque se requiere una menor cantidad de suero. La vía de inoculación es algo que varía y que se determina de forma empírica.

Una vez se inyecta el antígeno la respuesta inmunitaria adaptativa que es la que va a dar lugar a los anticuerpos va a pasar por distintas fases. 

En primer lugar va ha haber una fase de retardo o fase lag. Esta fase corresponde al tiempo que necesitan los linfocitos B para ser activado. La siguiente fase es la de crecimiento exponencial con un aumento brusco de los anticuerpos, en esta fase la producción de anticuerpos es mayor que la de degradación. Posteriormente se llega a una fase estacionaria en donde la síntesis es igual a la degradación, es el punto de mayor concentración de anticuerpos. Y finalmente llega la fase de decaimiento en donde la degradación de los anticuerpos supera a la síntesis y baja la concentración. Por tanto hay tendencia a pensar que el mejor momento para extraer el antisuero del animal es durante la fase estacionaria pero no es así.



Si después de el proceso de inmunización primaria se pone una segunda dosis del mismo antígeno se repiten las mismas fases que en el proceso de inmunización primaria pero de forma distinta. La fase lag es mucho más corta, la fase exponencial es mucho más violenta y la cantidad de anticuerpos es mucho mayor,  y la fase de decaimiento es mucho más lenta que en la inmunización primaria permitiendo así tener mayor cantidad de anticuerpos. A este fenómeno se le llama hiperinmunización y se debe al efecto de la memoria de los linfocitos B, además la hiperinmunización permite la selección de anticuerpos de mayor afinidad si se reduce la concentración del antígeno en las segundas inmunizaciones ya que se seleccionarán aquellos clones de linfocitos B que compitan mejor por el antígeno, es decir aquellos que tengan receptores con mayor afinidad por el antígeno y que después secretarán en forma de anticuerpos cuando se hayan diferenciado a células plasmáticas.

Durante la meseta de la hiperinmunización es cuando se debe obtener el suero del animal ya que la concentración de anticuerpos será mayor.

¿Cómo se obtienen los anticuerpos monoclonales?

Esto mejor lo dejaremos para la segunda parte de la entrada y que será publicada en unos días. 

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