MED 152, La importancia de la metagenómica

Ayer tuve la oportunidad de asistir a un pequeño, pero excelente, seminario de Carlos Pedrós del Instituto de Ciencias del Mar, impartido en el Instituto Cavanilles de Biología Evolutiva. En realidad el seminario trataba de el genoma de Polaribacter sp. MED152. Pero ha sido un ejemplo excelente de todo lo que la metagenómica puede aportar a la biología actual.

En realidad ya conocía esta bacteria cuando el año pasado hice un seminario  acerca de las proteorrodopsinas. En realidad MED 152 es resultado de un análisis metagenómico de una muestra de agua extraída en el mediterráneo (la 152) y que al parecer corresponde a una especie del género Polaribacter perteneciente al orden de las flavobacterias.

Es un microorganismo más de los que se añaden a la lista de aquellos que se han podido secuenciar en muestras marinas y que son difíciles de cultivar en el laboratorio porque sus condiciones de vida son difíciles de reproducir. Esta bacteria, además de por otras muchas cosas, se caracteriza también por poseer los genes necesarios para la síntesis de proteorrodopsina.

Las proteorrodopsinas son proteínas con 7 tramos transmembrana que poseen en su estructura una molécula de retinal. Estas proteorrodopsinas tienen la capacidad de bombear protones al exterior de la célula cuando son excitadas mediante una longitud de onda determinada (espero hacer en un futuro no muy lejano una entrada que hable de forma más detallada de éstas).

Aparte de los genes para la proteorrodopsina se han visto muchos genes relacionados con la luz, como por ejemplo los genes para la ruta de síntesis de los beta carotenos, de ahí ese color calabaza tan llamativo que podemos ver en la primera imagen. Pero aparte de estos genes necesarios en muchas ocasiones para protegerse frente ciertas radiaciones se han encotrado genes de sensibilidad a la luz como histidín quinasas que activan cascadas de fosforilación para transducir la señal hasta el DNA y allí desarrollar una respuesta efectora.

Es una bacteria marina y se ha visto que uno de los complejos de la cadena de transporte electrónico bombea sodio en lugar de protones y que está adaptada a vivir sobre superficies, tienen los genes necesarios para la motilidad por reptación, así como genes para la degradación de biopolímeros, al parecer viven asociados a pequeñas partículas de materia orgánica, cuando los nutrientes escasean pueden utilizar las proteorrodopsinas para la generación de gradiente de protones y utilizar la poca materia orgánica de la que disponen para el anabolismo, como por ejemplo las reacciones anapleróticas en el ciclo del ácido cítrico…

Estos son algunos de los datos que se han aportado durante la conferencia, pero si bien es cierto los análisis fisiológicos que se han hecho para averiguar estas características son inexistentes, todo, o casi todo, se ha deducido a partir de la comparación de secuencias, con secuencias que conocemos y sabemos qué codifican y porqué codifican determinadas proteínas, en eso consiste realmente la metagenómica, en secuenciar con genomas completos y comparar con lo que ya conocemos. De una secuencia de nucleótidos AGCTGCGA…se ha deducido la vida de la bacteria, cómo obtiene la energía o qué sustratos utiliza como fuente de carbono,  tan sólo a partir de su secuencia.

De aquí la importancia y el mundo de posibilidades que ha abierto la metagenómica en el campo de la biología. Los avances en tecnología de la secuenciación han dado lugar a nuevas posibilidades a la hora de secuenciar genomas completos con mayor rapidez y eficiencia, eso junto con procesadores cada vez más rápidos y complejos facilitan aún más la comparación con diferentes bases de datos y la obtención de resultados, sin duda, sorprendentes. 

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Contaminación y aterogénesis

Hace unos días  que leí esta noticia en mis consultas matutinas a los principales periódicos del país, así que me decidí ir a la raíz de la noticia y buscar el artículo que ha sido publicado con este título: Ambient Air Pollution and the Progression of  Atherosclerosis in Adults.

Ya se habló en otra entrada acerca del riesgo de formación de placas de ateroma cuando se discutió el posible efecto de las isoflavonas como prevención para el aumento de colesterol.

En este caso parece ser que han encontrado una relación estrecha entre la polución y el riesgo de padecer problemas cardiovasculares por el estrechamiento de los vasos.
 
Hasta el momento no se había realizado ningún estudio en humanos de esta magnitud, pero si en ratones y otros pequeños mamíferos, en los que sí se ha observado que a mayor polución menor diámetro en los vasos.

Para el estudio se han utilizado cinco casos clínicos en los que se midió el grosor de la túnica íntima/media (ver estructura) de la arteria carótida, el objetivo de estas medidas no eran la del artículo, se tomaron como un dato más para otros estudios pero los investigadores han aprovechado la existencia de estos datos para usar a estos individuos como elemento de estudio.

Cinco años después de los primeros estudios clínicos de los pacientes se midió de nuevo el grosor de la túnica media/íntima (CIMT) mediante métodos no invasivos, y además se estableció el lugar de residencia habitual para ver la distancia de sus viviendas a las grandes autovías (en el área de los Ángeles) y medir el nivel PM 2.5 que mide el nivel de partículas contaminantes de 2.5 um que van pululando por la atmósfera.

Estas pequeñas partículas son expulsadas por los vehículos, sobre todo aquellos que utilizan el diesel como combustible, y se ha comprobado que en aquellas autovías que son utilizadas como ruta de camiones el número de partículas es muy alto ya que en Norte América los vehículos particulares suelen utilizar gasolina como combustible.

Estas pequeñas partículas entran a través de las vías respiratorias y llegan al sistema alveolar, por su pequeño tamaño (capaces de pasar a los capilares) y porque algunas de ellas tienen capacidad óxido reductora activan el sistema inflamatorio y aumentan la aterogénesis aumentando posteriormente el riesgo de padecer problemas cardiovasculares.


Uno de los principales problemas con los que se han encontrado los investigadores es el tamaño poblacional, sólo 5 pacientes…además hay que tener en cuenta que estos 5 pacientes estaban en tratamiento por problemas cardiovasculares y eso complica distinguir si los cambios en el diámetro son producidos por la polución u otros factores, aunque parece ser que estos lo han conseguido. Ahora quieren ampliar la muestra y repetir el experimento.

Pero esto me plantea a mí una pregunta, ¿Estaremos haciendo bien en España en comprar nuestros coches particulares con motores diesel? Si bien es cierto que el combustible es más barato…¿qué precio pagaremos en un futuro?

FUENTE:

Künzli, Nino, Jerrett, Michael, Garcia-Esteban, Raquel, Basagaña, Xavier, Beckermann, Bernardo, Gilliland, Frank, Medina, Merce, Peters, John, Hodis, Howard N., and Mack, Wendy J., 2010. Ambient Air Pollution and the Progression of Atherosclerosis in Adults. Public Library of Science. 5: 90-96

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Von kossa y azul alcián

 

El haber terminado los exámenes me ha permitido desenpolvar aquellas preparaciones que tuve el placer de realizar durante las prácticas de Técnicas microscópicas.

Una de las preparaciones que mejor resultaron dieron fueron las que utilizamos la técnica de von Kossa y Azul alcián. Ambas técnicas son de tipo histoquímico. En el caso de von Kossa se produce una reacción en que las preparaciones que contengan fosfato cálcico, como son las que presentan mineral óseo, con el nitrato de plata conducen a la formación de un fosfato de plata, en presencia de luz la plata se reduce a plata metálica, de color marrón/negro y es fijada con un fijador como el tiosulfato sódico como ocurriría con un revelado fotográfico de los tradicionales.

Por otro lado el azul alcián tiñe específicamente mucopolisacáridos como por ejemplo los que se depositan durante la deposición de la matriz cartilaginosa. Ya hablamos del cartílago en una antigua entrada en donde se describió la estructura histológica y que recomiendo que leáis para comprender mejor esta entrada.

En este caso la técnica ha sido aplicada sobre un embrión de ratón. El objetivo es observar el proceso de deposición de matriz ósea en la transición de cartílago a hueso. Durante la embriogénesis el primer esqueleto que se forma es de tipo cartilaginoso, y posteriormente la entrada de osteoblastos a la matriz inician la deposición de matriz ósea sobre la cartilaginosa, y en esta predomina el fosfato cálcico, de manera que al aplicar el von Kossa en estas zonas se observará el precipitado negro/marrón de la plata, mientras que en las zonas en las que aún quede cartílago quedará el tejido teñido de azul.

Realicé unas cuantas capturas con la cámara CCD del microscopio y los resultados fueron los siguientes:

1. Vista general de zonas esqueléticas del embrión (4X):

 

En ambas fotos se puede ver la transición del cartílago de color azul y la zona de precipitado de fosfato cálcico que mediante esta técnica se representan mediante un precipitado metálico.

2. Más detalles de la zona de osificación:



 
En estas capturas se pueden ver los condrocitos rodeados ya de matriz ósea y en la segunda foto el perfil de algunos osteoblastos.

Recordad que si hacéis clic sobre las fotos podréis verlas más ampliadas.

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Un moho mucilaginoso Imita el sistema ferroviario de Tokio

Esta noticia y el artículo correspondiente salió publicado a finales de enero, pero por los exámenes y cuestiones de trabajo han hecho que me haya percatado hasta ayer cuando un compañero de laboratorio, Lucas, me advirtió de su existencia.

El experimento ha sido realizado por investigadores japoneses y británicos con el hongo mucilaginoso o Physarum polycephalum . Este moho es característico por su gran movilidad, su ciclo vital pasa por una fase de plasmodio en la que es capaz de desplazarse en busca de nutrientes y de condiciones óptimas para la vida, recuerda en pare al Dyctiostelium discoideum del que ya se habló en una antigua entrada. Incluso llega a dar bastantes problemas a la hora de cultivarlo ya que puede salirse de las placas y contaminar placas vecinas…

En este caso en el experimento se han colocado copos de avena localizados de forma específica como las ciudades que rodean la capital japonesa. Posteriormente se hizo un inoculo del moho en la parte central y vieron que el  moho se autoorganizaba, extendía y formaba una red comparable en eficiencia, fiabilidad y costo con la estructura ferroviaria de la red de Tokio.

Este moho crece en forma de red interconectada como estrategia para la búsqueda de nutrientes y explotación de nuevos recursos. Incluso es capaz de encontrar la ruta más corta a través de un laberinto hasta llegar a la fuente de alimentación. 
 
Los investigadores han realizado un modelo matemático para el crecimiento y formación de las redes entre las fuentes de alimento para aplicarlas posteriormente al diseño de redes de transporte.

En esta página podéis leer la noticia al completo y más amplia:



http://www.plataformasinc.es/index.php/esl/Noticias/Un-moho-crece-como-el-sistema-ferroviario-de-Tokio

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Histoquímica y genes repórter

 

Cuando queremos detectar algún tipo de actividad enzimática en microscopía óptica se recurre a la histoquímica, que consiste en utilizar sustratos alternativos a los originales (ya sea de forma directa o por una reacción acoplada) para que dé algún tipo de pigmentación o coloración que pueda ser detectada por microscopía óptica, y si el cromógeno tiene carácter metálico o afinidad por éstos se puede detectar también mediante microscopía electrónica.

De entrada la histoquímica plantea ya una serie de problemas, porque si nuestro objetivo es diferenciar estructuras el tejido debe fijarse de manera que se conserve al máximo la estructura y en el caso de la microscopía electrónica la ultraestructura, pero muchas veces estos fijadores se basan en la formación de enlaces covalentes entre ciertos residuos de la cadena peptídica, como por ejemplo entre residuos de Lys en el caso de los aldehídos. Esto puede afectar a la actividad enzimática ya que los cruzamientos pueden alterar (o no) el centro activo y eliminar cualquier posibilidad de reacción dando lugar a un falso negativo. Lo más recomendable en la mayoría de los casos es recurrir a la bibliografía o poner a prueba tu propio protocolo, por que al fin y al cabo si nuestro enzima es capaz de soportar agresivos procedimientos de fijación e inclusión pero que conservan al máximo la estructura, ¿por qué no utilizarlos?.

Soy consciente que el título trata también sobre genes repórter y ¿alguna relación tendrán con la histoquímica no? Pues si la tienen.

Los genes “repórter” o testigo, son genes que se utilizan para detectar la transcripción y traducción de otros genes que por su naturaleza no son visibles al microscopio., la relación que guardan con la histoquímica es que muchas veces el producto de este gen testigo es un enzima que se puede detectar con un sustrato cromogénico.

Hay que tener en cuenta que un buen gen  testigo no debe estar presente en el  organismo de estudio ya que así nos evitaremos falsos positivos, o bien si existe de forma endógena que este se pueda bloquear de forma específica. La utilización de un gen testigo requiere la manipulación del genoma, mediante técnicas de clonación al embrión o al propio zigoto se le debe incorporar el gen para su posterior expresión i revelado.

Un ejemplo de gen testigo bastante utilizado es el gen de la beta galactosidasa, es archiconocido (por el operón lac de E. coli), no está presente en la mayoría de los organismos de estudio y además tiene sustratos cromogénicos y fáciles de detectar en microscopía óptica, como por ejemplo el X-gal que por la actividad galactosidasa del enzima da lugar a un producto de color azul, si sois lectores asiduos del blog lo recordaréis por su uso en el vector puC de E. coli del que ya hablamos en otra entrada.

Yo mismo he tenido la oportunidad de usar este gen testigo en prácticas de la asignatura de Técnicas Microscópicas. En este caso usamos el gen lacZ asociado al gen de la Mhc, la cadena pesada de miosina de D. melanogaster. Por tanto las moscas transgénicas expresaban un gen quimérico Mhc.-lacZ. en la misma ORF de transcripción de la miosina se transcribía el gen lac, dando lugar a betagalactosidasa en aquellos tejidos en donde se exprese este gen.

La cadena pesada de miosina tiene una elevada tasa de transcripción en el músculo, ya que forma parte de los sarcómeros y es la encargada de dar el golpe de potencia durante la contracción muscular.

Para revelar el gen testigo en las moscas las anestesiamos y cortamos la cabeza y el abdomen, dejando tan sólo el tórax con el objetivo de ver los paquetes de musculatura esquelética que participan en el movimiento de las alas. Tras unos minutos de incubación con X-Gal lavamos con tampón y simplemente montamos sobre porta y cubre aplastando la mosca o haciendo lo que se conoce como squash. Hemos obtenido los siguientes resultados (si hacéis clic sobre la imagen se abrirá otra ventana con la imagen en tamaño original para más detalle):

1. Vista general del tórax:

 

El azul que se puede ver al final de las patas es el resultado del revelado con X-gal, la musculatura de las patas es la única que ha dado coloración azul y lo más probable es que la musculatura del tórax no haya quedado también en azul porque la solución de revelado no haya penetrado en su interior correctamente.

2. Detalle de los paquetes musculares de las patas:



En esta captura a 40X ya se puede observar con más detalles los paquetes de fibras musculares incluso el bandeado que existe entre las zonas de solapamiento de actina-miosina en el sarcómero, que son más oscuras y las que sólo hay actina, que son las bandas claras. Aquí tenéis el detalle más ampliado:

3. Detalle del paquete de fibras:

Por cierto, ¿alguna vez no os habéis planteado por qué las moscas tienen tanta facilidad para adherirse a cualquier superficie? Creo que con esta foto tendréis la respuesta:

  Con esas minúsculas uñas las moscas son capaces de adherirse a cualquier rugosidad de la superficie.











Este ha sido tan sólo un ejemplo de uso de genes testigo pero hoy en día son la base fundamental en muchos campos de la investigación biológica ya que son los únicos capaces de mostrar a nuestros ojos lo que está ocurriendo en las células.

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