Un mundo de insectos (una serie de documentales interesante)

La entrada de hoy va dedicado a los documentales. De ellos, hay que decir que

mucha gente los critica por considerar que son una manipulación de la realidad, ya que en ocasiones dan a entender que los animales pasan el día haciendo cosas curiosísimas y fascinantes, cuando en realidad, el comer, reproducirse, o pelearse por una hembra no va más allá de unos minutos o unas horas y el resto del tiempo lo dedican a permanecer quietos, camuflados o escondidos.

Independientemente de la información que proporcionen, la verdad es que hay algunos, cuyas imágenes no tienen desperdicio.

Sin ir más lejos, esta semana, en un canal autonómico, Canal 9 de la Comunidad Valenciana, están retransmitiendo unos reportajes muy curiosos acerca del mundo de los insectos.

En ellos, aparecen escenas del día a día de varios insectos, unos más comunes y conocidos que otros. Son escenas fantásticas que acercan un poco más al curioso y desconocido en muchas ocasiones, mundo de estos “bichitos”.

En este caso como en otros muchos, las explicaciones no son nada específicas, sólo dan pinceladas de hechos más o menos relevantes combinados con melodías perfectamente adaptadas a las imágenes que muestran. Visto así, cualquier animalejo parece entrañable. Es como ver la serie “Minuscule” pero con imágenes reales…

Las colecciones

Una de las cosas que todo biólogo debe aprender es a distinguir unos organismos de otros, reconocerlos, saber clasificarlos y si la ocasión lo requiere saber preservarlos.

Realizar un herbario o un insectario no es cosa de dos días, por lo que es en estos momentos cuando se pone a prueba uno de los atributos que todo investigador debe tener, la paciencia. Paciencia, que debe ir además asociada a ganas de campo y por supuesto habilidad y pericia.

Hace unos años, en la asignatura de Botánica se nos planteó el hecho de hacer un herbario. A simple vista pasear por el campo y recoger plantas no parece un trabajo engorroso, pero hay que tener cuenta que no nos vale cualquier planta que cojamos de cualquier manera, necesitamos recoger plantas con flores (en caso de que sean especies que tienen flor) para poder clasificarlas, con raíces si es posible y tomar al menos dos muestras (una para conservar y otra para clasificar) apuntar la zona en la que ha sido recogida y por supuesto tratar de conseguir que llegue en el mejor estado posible al laboratorio, para colocarla entre papel secante y periódicos en la prensa de secado.

La prensa se puede convertir en nuestro amigo o enemigo según nuestras habilidades. En las plantas que conservemos debe poder observarse la morfología y distribución de las hojas y de las flores, el número de pétalos y si cuando sea posible la raíz. Esto dependiendo de especies puede convertirse en toda una odisea, pero nunca hay que rendirse.

Si somos constantes y cada día cambiamos los periódicos o papel secante, al cabo de un mes tendremos la planta en la misma posición en la que la pusimos, completamente plana y totalmente seca, conservando sus características y su color. Así, nos puede durar decenas de años, siempre que protejamos nuestro herbario con alcanfor y una caja apropiada.

Este año, en la asignatura de Control de Plagas, nos propusieron hacer un insectario de organismos plaga, lo cual es perfecto para aprender la técnica de la conservación de insectos.

Como en casi todo, cada persona tiene su manera de hacerlo. Para la recolección de insectos podemos emplear trampas de muy diversos tipos, una manga entomológica, una simple bolsa de plástico o incluso las propias manos. Hay que ir con cuidado de no romperlos y por supuesto tener la precaución de matarlos lo más pronto posible para que no se estropeen una vez han sido capturados.

Para matarlos hay quien opta por ponerlos en un bote con un algodón impregnado de alcohol, esto permite preservarlos, el organismo muere embriago, lo cual si bien se mira tampoco es tan desagradable en comparación con la gente que opta por congelarlos o someterlos a otras sustancias mortales… Una vez muertos, hay que atravesarlos con alfileres entomológicos y disponer perfectamente cada pata con sus respectivos artejos, las antenas, las alas… cada grupo tiene unas directrices, de modo que las mariposas se disponen con las alas desplegadas, las mariquitas por ejemplo, sin desplegar… todo dependerá del manual que utilicemos.

Finalmente, sean plantas o insectos, todo debe llevar una etiqueta identificadora con al menos la familia, género, especie, fecha y zona de recolección, de esto modo siempre podremos saber dónde obtuvimos la especie y en qué momento del año.

Por último, sólo queda decir que las colecciones entre otras cosas, se utilizan para en primer lugar aprender las características de cada especie para posteriormente clasificarlas. En este proceso uno va conociendo un poco más la morfología y todos aquellos caracteres identificadores relevantes que se utilizan en las claves de clasificación. Esto es algo que para quien quiera dedicarse a la botánica o a la zoología es muy importante, por ello la causa parece estar justificada, sin embargo, no por ello implica ir arrancando plantas o cazando insectos de forma desconsiderada, siempre hay que coger únicamente lo necesario teniendo en cuenta que hay especies protegidas o en peligro de extinción, cuya recolección está prohibida.

La inmunoprecipitación selectiva de cromatina

Tuve la oportunidad de conocer esta técnica durante mi colaboración en el laboratorio de genómica de levaduras, y ya me sorprendió en su idea la elegancia con la que se podía precipitar la cromatina con esta técnica, y además de forma selectiva.

Muchas veces en biología molecular se desea conocer si una proteína de interés interacciona con el DNA

   y cuáles son los genes que regula. Para esto una de las técnicas que se utiliza es la inmunoprecipitación selectiva de cromatina.

Esta técnica tiene la ventaja de que se puede realizar in-vivo. Por ejemplo, nos puede interesar si nuestra proteína regula la transcripción ante una situación de estrés. Tras someter a las células a algún tipo de estrés, por ejemplo alta concentración de sales, se puede aplicar alguna sustancia que entrecruce las proteínas que interaccionan con el DNA, mediante glutaraldehído por ejemplo.

Una vez se produce el entrecruzamiento se lisan las células y el DNA se rompe en fragmentos mediante sonicación en fragmentos de 0,2 a 1 KB.

Hasta este punto no hemos utilizado ninguna técnica inmunológica, es ahora cuando entra en juego la inmunoprecipitación. Tenemos una mezcla de fragmentos de cromatina con proteínas unidas a través del crosslink ahora hay que separar nuestra proteína de interés del resto y esto se va a conseguir mediante inmunoprecipitación.

Tendremos un anticuerpo para nuestra proteína de interés adherida por ejemplo a un soporte físico como por ejemplo esferas de algún tipo de polímero (sefarosa). Tras aplicarlas a nuestra muestra el anticuerpo se unirá a nuestra proteína que a su vez llevará unido el DNA. Tras centrifugar en el fondo de nuestro tubo quedarán las esferas con el complejo proteína-DNA.

Una vez separada esta fracción del resto de la muestra se revierte el crosslinking. Mediante técnicas de biología molecular se precipita de forma selectiva el DNA y mediante PCR se amplifica. Una vez amplificado se puede secuenciar, de esta manera conoceremos la secuencia a la que se une la proteína y podemos ver en las bibliotecas de genómica (si está secuenciado) que gen o genes controla.

Si se hace para todas las proteínas que hay unidas en el DNA en lugar de secuenciar se hibrida el DNA en chips genómicos, en este caso se conoce como ChIP on ChIP.

Translocación de proteínas a través de membrana del Retículo Endoplásmico

Uno de los problemas que se plantearon los investigadores en su época (hablamos de los años 70…) es cómo las proteínas podían pasar a través de la membrana. Como todos vosotros sabéis las membranas son impermeables a una gran parte de compuestos y entre ellos las proteínas, por tanto la translocación de proteínas a través de la membrana se desconocía.

Hoy en día gracias a los experimentos realizados por científicos como Günter Blobel o Bernhard Dobberstein, no es difícil encontrar en los libros de texto un tema dedicado a la translocación de proteínas a través del retículo endoplásmico y es una pregunta clásica en exámenes, desde el bachillerato pasando por selectividad y llegando a cursos superiores de las carreras universitarias, eso sí con un incremento en el grado de detalle.

En esta entrada vamos a ver algunos de los rasgos de este mecanismo de translocación de proteínas.

En primer lugar,  y tal y como se vio mediante los experimentos, los mRNAs de proteínas de secreción traducidos in-vitro (sólo con extractos celulares) e in vivo no tenían la misma longitud. In vivo las proteínas resultantes eran más cortas que in vitro. De aquí se dedujo la presencia de un péptido señal.

Todas aquellas proteínas que van a pasar al lumen del RE poseen un péptido señal en la propia proteína que es eliminado tras ser translocada al lumen, explicando así las diferencias de tamaño.

A medida que el mRNA es traducido por el ribosoma aparece el péptido señal. Este péptido señal a pesar de no tener una secuencia consenso sí que comparte una serie de características comunes que son la presencia de un núcleo de aminoácidos apolares flanqueado por aminoácidos con carga. Nada más aparecer el péptido señal se le une la partícula SRP, que es una ribonucleoproteina que va a unirse al péptido señal por el dominio p54 que forma un bolsillo hidrofóbico de metioninas y a su vez al ribosoma, justo en el sitio en donde se interacciona el factor de elongación parando así la traducción de la proteína.

En ese momento SRP dirige al ribosoma y la cadena naciente a la superficie de la membrana del RE en dónde SRP tiene su receptor, en ese momento se produce la unión de GTP (la unión de la proteína y el receptor generan un sitio de unión de GTP) la hidrólisis de GTP a GDP produce un cambio conformacional que facilitan la liberación de SRP y del receptor quedando el  ribosoma anclado al translocón o Sec61. La interacción del péptido señal con el poro permite que se abra el paso del canal para que la proteína sea translocada.

A medida que se transloca la proteína al lumen el péptido señal es cortado por una peptidasa y la proteína naciente modificada mediante puentes disulfuro, glicosilaciones…hasta que alcanza la conformación definitiva.

Aquí tenéis un video de este proceso tan archiconocido en biología:

 

 

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El uso de la GFP como Chivato en Biología celular

La GFP o green fluorescent protein es una proteína producida por la medusa Aequorea victoria que emite bioluminiscencia en la zona del verde del espectro visible. El avance en las técnicas de biología molecular han permitido aislar este gen y en la actualidad es un marcador muy común en biología molecular y celular, además mediante modificaciones en la secuencia de aminoácidos mediante mutagénesis dirigida se ha conseguido variar el espectro de emisión de manera que en la actualidad hay GFP que emite en el amarillo (YFP) o en el rojo (RFP).







  

Este gen de la GFP mediante técnicas de biología molecular e ingeniería genética puede combinarse con otros genes. De manera que si queremos transformar o transfectar (en el caso de eucariotas) nuestras células con algún tipo de gen podemos usar la GFP como marcador. Tan sólo hay que poner en pauta la GFP con el gen de interés bajo un mismo promotor. De esta manera aquellas células que hayan incorporado el DNA con nuestro gen de interés podrán ser detectadas bajo un microscopio de fluorescencia porque emitirán un brillo verde al ser excitadas por la luz. Todas aquellas células que expresen la GFP estarán expresando el gen que está controlado bajo el mismo promotor, aunque la traducción de este gen no de lugar a ningún cambio perceptible a través del microscopio.

Una de las principales ventajas de la GFP es que no daña la viabilidad celular, de manera que si en un  cultivo de células que han sido sometidas a un proceso de transfectación el porcentaje de células transfectadas ha sido bajo pueden aislarse aquellas que estén brillantes mediante una micropipeta y establecer una línea de cultivo celular con ellas.

La GFP en la actualidad tiene múltiples usos y múltiples combinaciones en la actualidad, tanto como para llenar páginas y páginas con ejemplos. No obstante las fotos que os voy a colgar son de la práctica que hice la semana pasada en biología celular. En este caso se transfectaron células HEK 293 T con un plásmido portador de la GFP mediante dos protocolos ligeramente distintos para ver cuál de los dos era más efectivo a la hora de transfectar.

Para ver los resultados simplemente se ha utilizado un fluorocromo para DNA, el DAPI (color azul) y la propia bioluminiscencia de la GFP. Aquellas células que hayan incorporado nuestro gen de la GFP (y expresado) serán de color verde brillante. Ahora tan sólo queda ver la proporción entre células que lo han incorporado (verdes) del total de células que se pueden contar gracias al marcaje con DAPI que nos marca los núcleos. Aquí tenéis algunas de las fotos obtenidas:



























Células con DAPI: núcleos marcados en azul para hacer el recuento total de células

 

































Células con GFP: es la misma foto anterior pero con el filtro verde en el microscopio de fluorescencia







































 
Superposición de ambas fotos:

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